Cellules sénescentes RANKL+ sous stress mécanique : une cible thérapeutique pour la résorption radiculaire orthodontique par sénolytiques

International Journal of Oral Science volume 15, Article number: 20 (2023) Citer cet article

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En dentisterie, la résorption radiculaire orthodontique est un problème de longue durée sans stratégie de traitement efficace, et ses mécanismes, en particulier ceux liés aux cellules sénescentes, restent largement inconnus. Ici, nous avons utilisé un modèle de mouvement dentaire d'intrusion orthodontique avec une boucle en L chez le rat pour démontrer que les cellules sénescentes induites par le stress mécanique aggravent la résorption radiculaire apicale, qui a été empêchée par l'administration de sénolytiques (un cocktail de dasatinib et de quercétine). Nos résultats ont indiqué que les cémentoblastes et les cellules du ligament parodontal ont subi une sénescence cellulaire (p21+ ou p16+) et ont fortement exprimé l'activateur du récepteur du facteur nucléaire kappa B (RANKL) à partir du troisième jour, induisant par la suite des odontoclastes positifs à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et provoquant une résorption radiculaire apicale. Plus de cellules sénescentes p21+ exprimaient RANKL que de cellules sénescentes p16+. Nous n'avons observé que des changements mineurs dans le nombre de cellules non sénescentes RANKL+, alors que les cellules sénescentes RANKL+ ont nettement augmenté à partir du septième jour. Curieusement, nous avons également trouvé des cellules cathepsine K + p21 + p16 + dans la fosse de résorption radiculaire, suggérant des odontoclastes sénescents. L'administration orale de dasatinib et de quercétine a nettement réduit ces cellules sénescentes et les cellules TRAP+, atténuant finalement la résorption racinaire. Dans l'ensemble, ces résultats dévoilent ces stimuli aberrants dans les cellules sénescentes précoces RANKL+ induites par le mouvement dentaire intrusif orthodontique, qui jouent un rôle central dans l'odontoclastogenèse et la résorption radiculaire subséquente. Ces découvertes offrent une nouvelle cible thérapeutique pour prévenir la résorption radiculaire lors du déplacement orthodontique des dents.

La résorption radiculaire apicale pendant le traitement orthodontique est souvent un fléau pour les orthodontistes. Par exemple, dans certaines études antérieures, les taux d'incidence de résorption radiculaire ont été atteints à 90 % et 100 %.1 De plus, une résorption radiculaire apicale modérée à sévère survient chez 12 à 17 % des patients en orthodontie, provoquant parfois l'effet secondaire clinique imprévu, la perte de dents.2 Néanmoins, il n'existe actuellement aucun traitement préventif efficace. Ainsi, il est nécessaire d'explorer les cibles thérapeutiques voilées basées sur de nouveaux mécanismes.

La résorption radiculaire est un mécanisme complexe sous-jacent à un orchestre d'activation cellulaire non physiologique et de mobilisation de nombreuses cellules.3 Semblables aux ostéoclastes associés à la résorption osseuse, les odontoclastes émergent pour résorber les surfaces radiculaires.4,5 les mentoblastes et les cellules du ligament parodontal (PDL) expriment ce ligand.6,7 De plus, plusieurs facteurs de stress facilitent l'expression de RANKL, y compris l'inflammation, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et le stress mécanique non physiologique.8,9 6 Ainsi, compte tenu des similitudes entre l'ostéoclastogenèse et l'odontoclastogenèse,17 les médicaments contre l'ostéoporose (par exemple, le bisphosphate, qui provoque la mort cellulaire directe, et le dénosumab, un anticorps anti-RANKL qui empêche la formation d'ostéoclastes) ont été exclusivement étudiés pour traiter la résorption radiculaire.18,19 Cependant, jusqu'à présent, ces médicaments n'ont pas encore atteint l'application clinique.

La sénescence cellulaire est inévitable pour les cellules âgées, entraînant un arrêt irréversible de la prolifération, des signaux mitogènes forts, des télomères raccourcis, des dommages à l'ADN et une augmentation des ROS in vitro et in vivo. escence a été signalée dans les cémentoblastes et les cellules du ligament parodontal.26 D'autres chercheurs ont également démontré que les cémentoblastes subissent une sénescence cellulaire et une inhibition de la calcification en réponse à des stimuli de stress mécaniques. En outre, les progrès rapides des études sur la sénescence cellulaire ont révélé que les cellules sénescentes sont impliquées dans diverses maladies liées à l'âge et influencent la durée de vie en sécrétant des phénotypes sécrétoires associés à la sénescence, y compris des substances inflammatoires32 qui altèrent les tissus environnants.33

En 2015, un cocktail de médicaments composé de dasatinib (inhibiteur de la tyrosine kinase ; utilisé pour traiter la leucémie myéloïde chronique) et de quercétine (un flavonoïde d'origine végétale) a été identifié comme un agent spécifique induisant la mort cellulaire (c'est-à-dire un sénolytique) pour les cellules sénescentes (ci-après dasatinib et quercétine [D + Q])34. Depuis, son efficacité a été confirmée dans diverses maladies, telles que le diabète, la maladie d'Alzheimer ,35 et l'ostéoporose,36 et pour restaurer la régénération osseuse.37 Les essais de faisabilité clinique et le développement d'autres sénolytiques progressent continuellement.38,39 Par conséquent, les cellules sénescentes sont maintenant reconnues comme des cibles thérapeutiques pour diverses maladies.20 Ainsi, les cellules sénescentes sont une cible thérapeutique potentielle pour prévenir la résorption radiculaire. Néanmoins, on sait peu de choses sur l'association et la localisation des cellules sénescentes sous OTM et leur fonction dans la résorption racinaire.

Ici, nous montrons qu'un stress mécanique délétère par OTM induit des cémentoblastes sénescents RANKL-positifs (RANKL +) et des cellules PDL, exacerbant la résorption radiculaire dans les molaires de rat à l'aide d'un modèle de mouvement dentaire intrusif orthodontique avec une boucle en L. De plus, nous avons vérifié que l'administration orale de D + Q réduisait remarquablement le nombre de cellules sénescentes RANKL +, atténuant la résorption racinaire, indiquant que les cellules sénescentes induites par le stress mécanique sont une cible potentielle pour la thérapie de résorption racinaire.

Pour imiter la résorption radiculaire apicale, nous avons d'abord établi un modèle OTM de rat avec une boucle en L verticalement vers le bas illustrée sur les Fig. 1a, b. Une boucle en L est un appareil conventionnel utilisé dans le traitement orthodontique qui génère les forces et les moments souhaités pour déplacer les dents de manière prévisible. Par conséquent, la force se propage directement à l'apex et au tissu PDL sous forme de contrainte mécanique. Les premières molaires supérieures gauches (M1s) ont été soumises à une force mécanique (5 N) appliquée verticalement vers le bas en continu pendant 14 jours (Fig. 1c, d). Des rats sans traitement par boucle en L ont été utilisés comme groupe témoin (Fig. 1c, Fig. S1). L'analyse par tomodensitométrie (µ-CT) n'a montré aucun mouvement dentaire dans le groupe témoin après 14 jours (Fig. S1a), tandis que les M1 se sont significativement déplacés verticalement vers le bas après le jour 5 avec la boucle en L, indiquant que l'OTM a réussi à provoquer une force mécanique et un stress sur les tissus périapical (Fig. 1d, e).

Le modèle d'intrusion dentaire orthodontique chez le rat. a Un diagramme schématique du système de force de la boucle en L sur le modèle de mouvement dentaire orthodontique (OTM). Lignes bleues horizontales : jambes de la boucle en L au stade inactivé. Après avoir ajouté une force verticale (5 N : flèche rouge) aux jambes de la boucle en L à l'aide de résine, le M1 gauche est soumis à la force verticale (flèche verte) via des effets de levier (cercles rouges). M1 : première molaire, M2 : deuxième molaire, M3 : troisième molaire. b Images macroscopiques du modèle avec la boucle en L du côté vestibulaire (gauche) et frontal (grossissement faible et élevé : images du milieu et de droite, respectivement). c Un organigramme d'expérimentation animale (n = 4 par groupe). D dasatinib, Q quercétine. d Images de tomodensitométrie (μ-CT) reconstruites des molaires maxillaires gauches. Lignes blanches : la ligne de base pour mesurer la distance OTM de M1. Flèche jaune à double sens : la distance entre la pointe de M1 et la ligne de base. e Une analyse quantitative de la distance OTM à partir de (d), représentée sous forme de moyennes ± écarts-types. ****P < 0,000 1 ; ns non significatif

Par la suite, pour déterminer si le modèle OTM pouvait provoquer une résorption radiculaire, nous avons évalué l'apex de la racine mésiale du M1 à l'aide de µ-CT et de coloration histologique, y compris la coloration à la phosphatase acide tartrate-résistante (TRAP) pour la détection des odontoclastes. Des images de reconstruction μ-CT haute résolution et tridimensionnelles (3D) ont révélé que la morphologie de la surface radiculaire apicale changeait en fonction du temps, devenant irrégulière sous contrainte (Fig. 2a). De plus, l'analyse quantitative µ-CT a montré que la densité minérale moyenne des racines apicales (RMD) diminuait de manière significative à partir du jour de stress 5 (Fig. 2c). La coloration TRAP n'a pas identifié les odontoclastes (c'est-à-dire les cellules TRAP +) dans le groupe témoin (Fig. S1b). Cependant, dans le groupe OTM, des odontoclastes sont apparus à la surface de la racine à partir du troisième jour de stress, bien qu'ils soient peu nombreux (Fig. 2b, flèches noires). En revanche, davantage d'ostéoclastes (cellules TRAP+ : Fig. 2b, e, pointes de flèches noires) sont apparus à la surface de l'os alvéolaire à partir du jour de stress 3. Les odontoclastes ont rapidement augmenté à partir du jour de stress 5, coïncidant avec le début de la résorption radiculaire (Fig. 2b, d). Les images de coloration à l'hématoxyline-éosine (HE) ont indiqué qu'une résorption racinaire sévère s'est produite à l'apex des jours de stress 7 à 14 (Fig. 2b, pointes de flèches blanches).

Résorption radiculaire apicale dans les dents de rats soumis à un stress mécanique. a μ-CT et images de reconstruction tridimensionnelle de l'apex radiculaire mésial de la première molaire maxillaire gauche. b Images de la racine mésiale de la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et de la coloration à l'hématoxyline-éosine après application d'une contrainte mécanique. Flèches noires : Cellules odontoclastes TRAP+. Pointes de flèches noires : ostéoclastes TRAP+. Os alvéolaire Ab. Pointes de flèches blanches : fosse de résorption radiculaire. c Densité minérale racinaire (RMD) de l'apex mésial de la racine. d Numéros d'odontoclastes TRAP+ sur les surfaces radiculaires. e Numéros d'ostéoclastes TRAP+ sur la surface de l'os alvéolaire. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écarts-types. **P < 0,01, ***P < 0,001, ns non significatif. Barres d'échelle : 100 μm pour (a) et 250 μm pour (b). Pas de numéro

La stimulation du stress mécanique induit la sénescence cellulaire des cémentoblastes et des cellules PDL26,27 et régule positivement l'expression de RANKL,40,41,42 qui sont potentiellement associées à la résorption racinaire. Ainsi, nous avons vérifié la localisation des cellules positives pour la protéine de fixation du cément (CAP) exprimant des marqueurs de sénescence (p21 et p16) et RANKL en utilisant une coloration par immunofluorescence (Figs. 3a, 4a et S2a). De plus, en utilisant Ki-67 (un marqueur de prolifération bien connu) et la coloration TUNEL (utilisable pour la détection des dommages à l'ADN et de l'apoptose), nous avons confirmé la sénescence cellulaire et les dommages à l'ADN (Figs. S3 et S4). Les cémentoblastes et les cellules PDL sécrètent CAP; par conséquent, CAP a été utilisé pour les identifier. 43, 44, 45, 46 Ci-après, nous définissons les cellules CAP + sur la surface de la racine comme des cémentoblastes et les cellules CAP + dans PDL comme des cellules PDL.

Cellules RANKL+ et cellules sénescentes p21+ dans les tissus périapicales sous contrainte mécanique. a Coloration par immunofluorescence et co-localisation de la protéine de fixation du cément (CAP) et de l'activateur du récepteur du ligand du facteur nucléaire-kappa-Β (RANKL) avec p21 sous la contre-coloration 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans les tissus périapical après application d'un stress mécanique. Noyau : bleu (DAPI) ; CAP : vert ; RANG : blanc ; p21 : rouge. Barres d'échelle : 100 et 25 μm pour un grossissement faible et élevé, respectivement. Les flèches blanches et la ligne pointillée orange en (a) indiquent la zone de fosse de résorption radiculaire. Ligament parodontal PDL. a1 Cellules réactives à la fluorescence dans la fosse de résorption radiculaire. Barre d'échelle : 10 μm

Cellules RANKL+ et cellules sénescentes p16+ dans les tissus périapicales sous contrainte mécanique. a Coloration par immunofluorescence et co-localisation de la protéine de fixation du cément (CAP) et RANKL avec p16 sous la contre-coloration DAPI dans les tissus périapical après application d'une contrainte mécanique. Noyau : bleu (DAPI) ; CAP : vert ; RANG : blanc ; p16 : rouge. Barres d'échelle : 100 et 25 μm pour un grossissement faible et élevé, respectivement. Les flèches blanches et la ligne pointillée orange en (a) indiquent la zone de fosse de résorption radiculaire. Ligament parodontal PDL. a1 Cellules réactives à la fluorescence dans la fosse de résorption radiculaire. Barre d'échelle : 10 μm

Les figures 3 à 5, les figures S1c et S2a montrent les distributions spatio-temporelles des cellules exprimant CAP, RANKL, p21 ou p16 dans les tissus périapicales et les nombres quantifiés. Dans le groupe témoin, les cémentoblastes et les cellules PDL exprimant RANKL ou p21 n'ont pas été observés après 14 jours sans OTM (Fig. S1c). En revanche, les cellules RANKL +, p21 + et p16 + sont apparues dans les tissus périapicales sous contrainte mécanique (Fig. 3, 4 et Fig. S2a). Le nombre de cellules prolifératives a diminué parallèlement à l'augmentation des marqueurs p21 (Fig. S3), tandis que les cellules endommagées par l'ADN (cellules TUNEL +) ont augmenté (Fig. S4) sous le stress mécanique. Les cémentoblastes RANKL + et les cellules RANKL + PDL (c'est-à-dire RANKL + CAP +) sont apparus à partir du jour de stress 3 et ont nettement augmenté les jours de stress 5 et 7 (Fig. 5a). De même, les cémentoblastes sénescents et les cellules PDL (cellules p21 + CAP + ou p16 + CAP +) ont augmenté du 3e au 7e jour de stress (Fig. 5b, c). Bien que nous n'ayons pas pu comparer directement les nombres absolus de cellules p21+ et p16+ en raison de sections différentes, nous pouvons conclure que le nombre de cellules p21+ a augmenté plus tôt que les cellules p16+ compte tenu de la différence statistique par section. Parmi ces cellules sénescentes, nous avons retrouvé des cémentoblastes RANKL+ et des cellules PDL dans les tissus périapical (Figs. 3 et 4). Les figures 3a1 et 4a1 présentent des cémentoblastes sénescents RANKL+ représentatifs dans la fosse de résorption radiculaire.

Analyse de la proportion de cémentoblastes sénescents (p21+ ou p16+) ou RANKL+ et de PDL dans les tissus périapicals. a Le nombre de cémentoblastes RANKL+ ou de cellules RANKL+ PDL dans les tissus périapicals. Cémentoblastes : cellules CAP+ à la surface de la racine ; Cellules PDL : cellules CAP+ dans PDL. b, c Le nombre de cémentoblastes p21+ ou p16+ ou de cellules PDL dans les tissus périapicales. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écarts-types. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns non significatif. Pas de numéro

Pour disséquer le caractère des cémentoblastes ou des cellules PDL (cellules CAP +) sous contrainte mécanique, nous avons en outre classé chaque cellule en fonction de l'expression du marqueur sénescent (p21 et p16) et RANKL (Fig. 6 et 7 pour les cémentoblastes et les cellules PDL, respectivement). Dans les cémentoblastes sénescents (p21 + ou p16 +; cercles rouges brisés sur les Fig. 6a – c), les cellules RANKL + ont augmenté au fil du temps jusqu'au jour de stress 7, alors que les cellules RANKL– n'avaient que des changements mineurs (Fig. 6b, c); ces résultats suggèrent que la plupart des cémentoblastes sénescents exprimaient RANKL. Pendant ce temps, dans les cellules PDL sénescentes (p21 + ou p16 +; cercles rouges brisés sur la Fig. 7a – c), les cellules sénescentes RANKL + et RANKL– ont augmenté de manière similaire jusqu'au jour de stress 7. Bien que nous n'ayons pas pu élucider les raisons des différences ci-dessus, ces résultats démontrent que les cémentoblastes sénescents et les cellules PDL expriment de manière sensible RANKL en réponse au stress mécanique dans le tissu périapical.

Classification des cémentoblastes RANKL+ ou sénescents dans les tissus périapical sous mouvement orthodontique des dents (c.-à-d. contrainte mécanique). a Représentations schématiques des cémentoblastes RANKL+ ou sénescents sous contrainte mécanique. Cercles brisés rouges : cellules sénescentes exprimant ou non RANKL de (b) et (c). Cercles brisés bleus : Cellules RANKL+ exprimant ou non les marqueurs sénescents (p21 ou p16) de (d) et (e). b, c Expression de RANKL dans les cémentoblastes sénescents (p21+/CAP+/DAPI ou p16+/CAP+/DAPI). d, e Expression du marqueur sénescent (p21 ou p16) dans les cémentoblastes RANKL+ (RANKL+/CAP+/DAPI). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écarts-types. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns non significatif. Pas de numéro

Classification des cellules RANKL+ ou PDL sénescentes dans les tissus périapicales sous mouvement dentaire orthodontique (c.-à-d. stress mécanique). a Représentations schématiques de cellules RANKL+ ou PDL sénescentes sous contrainte mécanique. Cercles brisés rouges : cellules sénescentes exprimant ou non RANKL de (b) et (c). Cercles brisés bleus : Cellules RANKL+ exprimant ou non les marqueurs sénescents (p21 ou p16) de (d) et (e). b, c Expression de RANKL dans les cellules PDL sénescentes (p21+/CAP+/DAPI ou p16+/CAP+/DAPI). d, e Expression du marqueur sénescent (p21 ou p16) dans les cellules RANKL+ PDL (RANKL+/CAP+/DAPI). Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écarts-types. **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,000 1, ns non significatif. Pas de numéro

Ensuite, nous avons analysé la proportion de cellules sénescentes (p21 + ou p16 +) dans les cémentoblastes RANKL + (cercles bleus brisés sur les figures 6a, d, e). Le nombre de cellules p21– et p21+ n'a pas différé jusqu'au jour de stress 5, puis les cellules p21+ ont nettement augmenté à partir du jour de stress 7 (Fig. 6d). Pendant ce temps, le nombre de cellules p16+ était systématiquement inférieur au nombre de cellules p16– jusqu'au jour de stress 14. Il convient de noter que les cellules p21– représentent des cellules non sénescentes car p21 est un facteur connu de sénescence précoce.47 Cependant, les cellules p16– ne sont pas toujours des cellules non sénescentes car elles comprennent également des cellules p21+ sénescentes précoces ; Les expressions de p21 et p16 se chevauchent à la fin de la sénescence.47 La propension des cellules PDL sénescentes sous stress mécanique est cohérente avec le résultat sénescent des cémentoblastes (Fig. 7d, e). Collectivement, RANKL était principalement exprimé dans les cellules sénescentes p21+ plutôt que dans les cellules non sénescentes et les cellules p16+.

Pour tester si l'odontoclaste a subi une sénescence cellulaire, nous avons coloré les coupes de tissus périapicales en utilisant un anticorps pour un marqueur odontoclaste (cathepsine K) avec des marqueurs sénescents (p21 et p16). Curieusement, nous avons trouvé des cellules multinucléaires cathepsine K + p21 + p16 + dans la fosse de résorption racinaire (Fig. 8 et S2b), mais pas dans les groupes sans stress au jour 14 (Fig. S5).

Odontoclastes sénescents à la fosse de résorption radiculaire. Images d'immunofluorescence des sites de résorption racinaire colorés avec de la cathepsine K, p21, p16 et DAPI après 14 jours de stress mécanique. Noyau : bleu (DAPI) ; cathepsine K : blanc ; p21 : rouge ; p16 : vert. Barre d'échelle = 100 μm et 25 μm pour un grossissement faible et élevé, respectivement. Les flèches blanches et la ligne pointillée orange indiquent la zone de résorption radiculaire. Os alvéolaire Ab

Pour clarifier la fonction des cémentoblastes sénescents RANKL + et des cellules PDL pour la résorption des racines dentaires, nous avons administré par voie orale un sénolytique (D + Q) aux rats sous stress mécanique les jours 1 et 7 (Fig. 1c). La dose sénolytique a été définie à partir d'études précédentes.48 Le nombre de cellules RANKL+ sénescentes (p21+ ou p16+) et de cellules cathepsine K+p21+p16+ a significativement diminué dans le groupe D + Q (Figs. 9a, b et S6) à partir de la surface radiculaire ; le nombre de cellules Ki67 + (cellules de prolifération) a été restauré, tandis que les cellules TUNEL + (cellules apoptotiques) ont augmenté (Figs. S3 et S4). Le nombre total de cémentoblastes et de cellules PDL a également diminué dans les tissus périapical (Fig. 9c). De plus, les cellules TRAP + et les cellules multinucléaires de la cathepsine K + p21 + p16 + ont significativement diminué à partir de la surface de la racine (Figs. 9d, f et S6). Cependant, nous avons toujours identifié des cellules TRAP + et cathepsine K + (mais pas de p21 + p16 +) sur l'os alvéolaire (Fig. 9d et S6) malgré le fait que les cellules sénescentes étaient réduites (Fig. S6) et étaient à certains endroits co-localisées près des ostéoclastes sous la contrainte mécanique (Fig. S7). Des images µ-CT haute résolution avec reconstruction 3D et analyses quantitatives ont déterminé que les racines avaient une surface plus lisse avec l'administration de D + Q que sans D + Q. Le RMD de la partie apicale proximale était plus élevé dans le groupe D + Q que dans le groupe sans D + Q (Fig. 9e, f). Le mouvement dentaire après l'administration de D + Q a diminué d'environ 50 % (Fig. 10). Le résultat indique que l'administration orale de sénolytiques a efficacement atténué la résorption radiculaire sous contrainte mécanique en éliminant les cellules sénescentes RANKL + (Fig. 11), alors qu'une élucidation plus détaillée et une amélioration prudente sont nécessaires pour faire progresser cette thérapie pour une utilisation clinique.

L'administration orale de sénolytiques a empêché la résorption radiculaire. Les rats ont été traités avec du dasatinib (D) + quercétine (Q) ou laissés sans traitement aux jours 1 et 7 pendant le mouvement dentaire orthodontique (c'est-à-dire le stress mécanique) pendant 14 jours. a Images d'immunofluorescence des tissus périapical colorés avec CAP, RANKL, p21, p16 et DAPI. Noyau : bleu (DAPI), RANKL : blanc ; CAP : vert ; p21 ou p16 : rouge. Barre d'échelle = 100 μm et 25 μm pour un grossissement faible et élevé, respectivement. b Le nombre de cémentoblastes RANKL+p21+ et de cellules PDL ou de cémentoblastes RANKL+p16+ et de cellules PDL dans les tissus périapicales. c Cementoblastes et cellules PDL (cellules CAP+) dans les tissus périapicales. d Coloration TRAP et images μ-CT de l'apex radiculaire mésial. Barres d'échelle : 100 μm pour les images μ-CT et 250 μm pour la coloration TRAP. e Images de reconstruction tridimensionnelle de l'apex radiculaire mésial de la première molaire maxillaire gauche. f Le nombre de cellules TRAP+ aux apex et la densité minérale racinaire (RMD) des apex racinaires mésiaux. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± écarts-types. *P < 0,05, **P < 0,01, ****P < 0,000 1. Pas de chiffre

Mouvement dentaire avec ou sans administration de D + Q au jour 14. Les rats ont été traités avec D + Q ou non traités aux jours 1 et 7 pendant le mouvement dentaire orthodontique (c'est-à-dire le stress mécanique) pendant 14 jours (Fig. 1c). a Images μ-CT reconstruites des molaires maxillaires gauches. Lignes blanches : la ligne de base pour mesurer la distance OTM de M1. Flèche jaune à double sens : la distance entre la pointe de M1 et la ligne de base. Barre d'échelle : 1 mm. b Une analyse quantitative de la distance OTM. Les données sont représentées sous forme de moyennes ± écarts-types. ****P < 0,000 1

Diagramme schématique illustrant la prévention de la résorption radiculaire à l'aide de dasatinib et de quercétine après des mouvements dentaires orthodontiques

Nous avons trouvé des cellules sénescentes RANKL+ et des odontoclastes TRAP+ autour de la racine apicale avec OTM. L'administration orale répétée de D + Q a diminué le nombre de ces cellules et a nettement atténué la résorption radiculaire. Ces résultats indiquent que la sénescence induite par un stress mécanique joue un rôle crucial dans la résorption racinaire, qui peut être évitée avec les sénolytiques.

Dans cette étude, nous avons réussi à induire des forces verticales et des contraintes mécaniques sur les M1 maxillaires gauches de rats à l'aide d'une boucle en L (Fig. 1). Les OTM ont été imités dans de nombreuses études avec plusieurs modèles expérimentaux, tels que des modèles de mouvement horizontal des dents utilisant des chaînes élastiques,49 des ressorts hélicoïdaux fermés,50 et des appareils de type quad helix,51 entre autres.52 Cependant, ces modèles expérimentaux ont principalement induit un mouvement horizontal des dents. Pendant ce temps, seules quelques études ont tenté de développer un modèle de mouvement dentaire d'intrusion pour induire une résorption radiculaire dans les pointes radiculaires,52,53 même si les traitements orthodontiques utilisent souvent un mouvement dentaire vertical qui génère une force d'intrusion. Dans le mouvement dentaire vertical, la racine apicale et les tissus parodontaux subissent des contraintes mécaniques élevées, ce qui augmente le risque de résorption radiculaire54,55. Après une résorption radiculaire temporaire et une restauration ultérieure du cément,56 l'extrémité radiculaire s'aplatit progressivement et ne retrouve pas entièrement sa longueur.57 En conséquence, la résorption radiculaire apicale est plus sévère que la résorption radiculaire latérale.58 Notre modèle préparé ne nécessite que du fil d'acier inoxydable et il est facile de régler les boucles sur les dents. Pendant ce temps, la préparation de la forme de la boucle en L nécessite des compétences orthodontiques.

Nos analyses µ-CT et histologiques ont montré qu'une résorption radiculaire apicale sévère commençait vers le cinquième jour de stress (Fig. 2a, b). Fait intéressant, la résorption radiculaire apicale a retardé la résorption osseuse avec l'OTM (Fig. 2a). De plus, plus d'ostéoclastes TRAP+ que d'odontoclastes TRAP+ ont commencé à apparaître au niveau de l'os alvéolaire au jour de stress 3 (Fig. 2b, d, e). Bien que divers chercheurs aient étudié les odontoclastes et les ostéoclastes in vivo et in vitro,59 la différence dans la formation de ces deux types de cellules in vivo reste totalement floue. Des études antérieures ont rapporté que les cémentoblastes stimulés mécaniquement expriment moins de RANKL que les ostéoblastes10 et que la sensibilité à la stimulation mécanique diffère dans les cémentoblastes et les ostéocytes60.

Bien que p21 et p16 soient des marqueurs importants liés à la sénescence, leur cinétique d'expression diffère.61 Dans notre étude, les cellules p21+ sont apparues plus tôt que les cellules p16+ dans les tissus périapical soumis à un stress mécanique vertical (Figs. 3, 4 et 5). Des études antérieures ont rapporté que les incréments d'expression de p21 diminuaient considérablement après avoir atteint la sénescence cellulaire, alors que celle de p16 se poursuivait pendant un certain temps, puis augmentait à la fin de la durée de vie cellulaire et au début de la différenciation. Ainsi, certains ont récemment proposé que p21 est un marqueur de sénescence précoce et p16 est un marqueur de sénescence tardive. tosis et la prolifération cellulaire en réprimant la traduction des gènes cibles par la voie de signalisation p5362 (la voie principale régulant l'expression de p2161). Étant donné que p21 était systématiquement plus fortement exprimé que p16 à partir du jour 3 de notre étude, nos données prouvent que le stress mécanique induit par l'OTM produit également des cellules sénescentes de l'ordre de p21 à p16, même in vivo (Fig. 5).

Des études antérieures ont montré que les cémentoblastes et les cellules PDL produisent potentiellement RANKL sous des stimuli de stress mécanique in vitro.12,16 Une expression élevée de RANKL favorise la conversion des cellules de la lignée monocyte-macrophage en pré-odontoclastes et augmente l'activité de résorption racinaire.3 à partir du jour de stress 7 (Figs. 6d, 7d). Ces résultats suggèrent que les cellules RANKL+ non sénescentes et RANKL+ sénescentes contribuent à l'initiation de l'odontoclastogenèse. Cependant, ce dernier joue peut-être un rôle essentiel dans l'aggravation ou la maturation de cette formation. En effet, nous avons éliminé la plupart des odontoclastes TRAP et Cathepsine K + en éliminant les cellules sénescentes à l'aide de sénolytiques (D + Q) (Figs. 9d, f et S6).

L'administration de D + Q a réduit de manière significative le nombre de cellules RANKL +, p21 + et / ou p16 +, entraînant une inhibition de la résorption racinaire (Fig. 9a – f). Le dasatinib est connu pour inhiber l'expression de RANKL dans les cellules stromales de la moelle osseuse63 et la formation d'ostéoclastes;64,65 le médicament pourrait inhiber directement l'expression de RANKL à partir de cémentoblastes sénescents et la formation de PDL et d'odontoclastes à partir de pré-odontoclastes. Parallèlement, des études antérieures ont montré que la stimulation mécanique incite les cellules à sécréter des ROS66 et des cytokines inflammatoires.67 Ces facteurs paracrines peuvent endommager l'ADN et induire une sénescence cellulaire.68 De plus, les cellules de la lignée monocyte-macrophage exposées à des ROS exogènes activent la cascade de signalisation RANKL, conduisant à la formation d'ostéoclastes. -les cellules sénescentes pour produire des substances inflammatoires ou ROS, qui peuvent empêcher l'induction de cellules sénescentes et l'activation de la signalisation RANKL sans provoquer la mort cellulaire. Cependant, nous avons administré D + Q les jours de stress 1 et 7, et le nombre total de cellules CAP+ dans les tissus périapical a également diminué le jour de stress 14 (Fig. 9c) ; Les cellules TUNEL + ont augmenté au jour 8 (Fig. S4). Par conséquent, nous supposons que D + Q avait diverses fonctions : entraver l'induction de la sénescence cellulaire dans la phase précoce, provoquer la mort cellulaire des cellules sénescentes RANKL + et empêcher la formation d'odontoclastes à partir de pré-odontoclastes, ce qui empêche la résorption des racines dans la phase tardive.

Des études antérieures ont rapporté que la stimulation de RANKL provoque l'expression de p21 lors de la formation des ostéoclastes.70 Ainsi, nous ne pouvons pas conclure si les odontoclastes subissent une sénescence cellulaire uniquement à partir de l'expression de p21. Cependant, dans cette étude, nous avons trouvé un nombre limité de cellules multinucléaires cathepsine K + p21 + p16 + dans la fosse de résorption racinaire (Fig. 8), suggérant que les odontoclastes sénescents existent sous stimulation mécanique. Bien que les différences fonctionnelles entre les cellules sénescentes de type odontoclaste et les autres odontoclastes soient actuellement inconnues, certains cas de résorption radiculaire apicale ne se sont pas rétablis depuis 25 ans.71 Compte tenu des caractéristiques des cellules sénescentes contournant l'apoptose, les odontoclastes sénescents peuvent survivre à long terme et contribuer à la sévérité de la résorption radiculaire.

Dans cette étude, nous avons démontré que les cellules sénescentes induites par le stress mécanique induites par l'OTM contribuaient à la résorption racinaire. Cependant, des examens plus détaillés sont indispensables pour explorer les mécanismes sous-jacents aux relations entre les cellules sénescentes, l'odontoclastogenèse et la résorption radiculaire. Par exemple, il existe un écart entre le nombre de cellules sénescentes RANKL+ et d'odontoclastes lors de la résorption radiculaire (d'autres cellules, molécules, etc., peuvent contribuer à la formation des odontoclastes). L'association à long terme des cellules sénescentes avec la résorption radiculaire reste incertaine. De plus, nous devons comparer avec prudence les résultats chez les humains et les rats. D'autres conditions, telles que des intervalles d'administration, des durées et des concentrations distincts, entraîneraient des résultats différents. Un examen plus approfondi est essentiel pour vérifier quels agents sénolytiques sont applicables pour une utilisation clinique afin d'éviter les effets secondaires. Fait important, bien que notre étude n'ait pas pu élucider les mécanismes moléculaires détaillés entre l'expression de RANKL et la formation d'odontoclastes induite par la sénescence cellulaire sous contrainte mécanique à l'aide d'essais in vitro, ces données renforceraient l'association des cellules sénescentes avec la formation d'odontoclastes. Les mécanismes doivent être élucidés en détail. Cependant, à notre connaissance, il s'agit de la première étude démontrant que les cémentoblastes sénescents induits par un stress mécanique ou cellules PDL jouent un rôle crucial dans les mécanismes de résorption racinaire in vivo ; le sénolytique représentatif utilisé dans cette étude a empêché l'odontoclastogenèse et la résorption radiculaire. De plus, la distribution spatio-temporelle des cellules sénescentes et des odontoclastes dans les tissus périapical sous le mouvement dentaire orthodontique a été révélée. Ces découvertes peuvent fournir de nouvelles informations sur le développement de nouvelles méthodes de prévention et de traitement de la résorption radiculaire, qui est une préoccupation de longue date pour les cliniciens depuis le début du traitement orthodontique.

Tout d'abord, un fil d'acier inoxydable de 0,014 pouce (Ormco Corp. Brea, Californie, États-Unis) a été plié avec une pince à fil léger, illustré sur les Fig. 1a, b illustrant les formes initiale et activée, respectivement. La conception est basée sur le motif de boucle en L couramment utilisé dans le traitement orthodontique clinique. Les critères de conception spécifiques étaient : (1) les boucles en L ont été réalisées avec un pas vertical de 1 mm entre la ligne distale de la boucle et la ligne mésiale de la boucle dans la forme initiale, et (2) les boucles en L ont été activées en poussant la ligne distale vers le bas à la même hauteur que la ligne mésiale. La force verticale lors de l'activation était de 5 N. Pour confirmer la cohérence de la boucle en L, une force de test verticale à l'état activé a été mesurée pour la boucle en L utilisée dans l'expérience avec un appareil de test universel au département de recherche sur les biomatériaux de l'Université dentaire d'Osaka. Le même expérimentateur a répété la mesure trois fois pour obtenir une force d'essai moyenne de 5 N comme modèle OTM.

Le comité d'éthique local de l'Université dentaire d'Osaka a approuvé les expérimentations animales et les politiques pertinentes ont été strictement suivies (numéro d'approbation : 22-02031). Des rats Sprague Dawley (mâles, âgés de 15 semaines) pesant 400 à 450 g ont été utilisés pour le groupe expérimental afin d'éviter la génération de cellules sénescentes liées à l'âge qui affecteraient l'expérience. Tous les rats ont été achetés chez SHIMIZU Laboratory Supplies (Kyoto, Japon). Les modèles OTM ont été ajustés comme indiqué sur les Fig. 1a, b. Après une anesthésie générale utilisant un mélange de trois agents anesthésiques (tartrate de butorphanol : 2,5 mg·kg-1, midazolam : 2 mg·kg-1, chlorhydrate de médétomidine : 0,15 mg·kg-1), une boucle en L a été placée sur la M1 gauche des rats (Fig. 1b). Les fils sur les surfaces occlusales des deuxième et troisième molaires ont été poussés verticalement pendant la fixation, et de la résine (Kuraray Noritake, Nigata, Japon) a été utilisée pour fixer les fils sur la partie distale des surfaces occlusales M2 et M3. Ensuite, la boucle en L a été activée et une force de 5 N a été appliquée sur la surface occlusale M1. Nous avons utilisé 32 rats, répartis comme suit (4 rats par groupe ; Fig. 1c) : 1. Groupe sans traitement (Contrôle) : euthanasiés après 14 jours ; 2. Groupes expérimentaux : euthanasiés les jours 0, 3, 5, 7 et 14 après l'installation de la boucle en L ; 3. Groupes 8j+D+Q et 14j+D+Q : administration des sénolytiques D+Q les jours 1 et 7 après l'installation de la boucle en L et euthanasie les jours 8 ou 14.

Pour observer la morphologie de l'OTM et la résorption racinaire, des échantillons de maxillaire de rat ont été scannés par μ-CT (SkyScan 1275, Bruker Co., Billerica, MA, USA) avec une tension de 85 kV, un courant de 65 μA et une haute résolution de 1944 × 1546. Les données 3D ont été reconstruites à l'aide du logiciel SkyScan™ CT Analyzer (version 1.17.7.2) et Mimics (logiciel 13.1 Materialise, Louvain, Belgique). Des lignes de référence ont été tracées le long du côté buccal de la molaire gauche des rats au niveau des cuspides mésiales et distales (Fig. 1d). La distance verticale entre la cuspide mésiale du M1 et la ligne de référence a été considérée comme OTM (Fig. 1d). Les mesures ont été effectuées à l'aide d'ImageJ (version : 2.1.0, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, États-Unis). La RMD moyenne de l'apex radiculaire mésial du maxillaire gauche M1 a également été quantifiée.72

Les échantillons ont été fixés dans du formol neutre à 10 % pendant 24 h. Après déminéralisation dans la solution de déminéralisation neutre B d'acide éthylènediaminetétraacétique (c'est-à-dire EDTA) (Cat No. LEP2494; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) à 4 ° C pendant 2 semaines, les dents ont été déshydratées dans un gradient de saccharose. Des coupes congelées sur tous les échantillons ont été préparées à l'aide de la méthode de Kawamoto.73 Des coupes congelées en série de 10 µm d'épaisseur ont été obtenues à l'aide d'un cryotome (Leica CM3050S ; Leica Biosystems, Richmond, IL, USA). La coloration HE des sections déminéralisées a été réalisée en utilisant des procédures standard suivant une méthode rapportée précédemment.48 La coloration TRAP a été réalisée à l'aide du kit de coloration (Cat. No. 294-67001 ; Fujifilm Wako Pure Chemicals Corporation) pour confirmer les odontoclastes et les ostéoblastes. Les images ont été prises avec un microscope numérique BZ-9000 (Keyence Corporation, Osaka, Japon).

Les coupes décalcifiées ont été revitalisées à l'antigène avec une solution de récupération d'antigène à 10 % HistoVT One (n° de catalogue 06380-76, Nacalai Tesque. Inc. Kyoto, Japon), puis bloquées et perméabilisées dans du sérum de chèvre à 5 % et du Triton X-100 à 0,3 % dans une solution saline tamponnée au phosphate, respectivement. Ensuite, les coupes ont été conjuguées avec des anticorps primaires : anticorps polyclonal anti-p21 ALEXA FLUOR® 555 (Cat. No. : bs-10129R-A555, Bioss Antibodies Inc, Woburn, MA, USA, 1:100), anticorps polyclonal anti-p16 ALEXA FLUOR® 594 (Cat. No. : bs-23881R-A594, 1:100), conjugué anticorps polyclonal anti-p16 ALEXA FLUOR® 488 (Réf. : bs-23881R-A488, 1:100), conjugué anti-RANKL ALEXA FLUOR® 647 (Réf. : bs-20646R-A647, 1:100), conjugué anti-cathepsine K ALEXA FLUOR® 647 (Réf. : SC-48353 AF647, Santa Cruz Biotechnology. Inc, Californie, États-Unis, 1:100), et conjugué ALEXA FLUOR® 488 anti-protéine d'attachement au ciment (3G9) (réf. : SC-53947 AF488, 1:100), conjugué anti-Ki67 ALEXA FLUOR® 488 (réf. : 118825, Cell Signaling Technology, Inc. , Beverly, Massachusetts, États-Unis, 1:100). Les coupes ont été incubées pendant une nuit à 4 °C et montées avec DAPI-Fluoromount-G®. Ensuite, ils ont été observés sous un microscope confocal laser (LSM-700, Zeiss-Microscopy, Jena, Allemagne).

Tous les réactifs de coloration TUNEL ci-dessus ont été obtenus à partir des kits de dosage CF™ Dye TUNEL ALEXA FLUOR® 647 (Cat. No. 30074, Fermont, CA, Biotium, Inc.). Toutes les coupes ont été colorées selon le protocole du kit et montées avec DAPI-Fluoromount-G®. Toutes les sections ont été observées sous un microscope confocal laser (LSM-700, Zeiss-Microscopy, Jena, Allemagne).

Les analyses quantitatives de TRAP, de coloration TUNEL et de coloration par immunofluorescence ont été calculées comme suit : la région d'intérêt (ROI) dans chaque section a été analysée sous un champ de vision de 10 × (coloration TRAP) ou 20 × (TUNEL et immunofluorescence). Ensuite, une couche de cellules de cément sur la ligne de démarcation du bord de la racine a été sélectionnée comme ROI de la surface de la racine par section. La plage de la couche externe de cellules sur la ligne de démarcation à la surface de l'os alvéolaire a été prise comme ROI de la zone PDL. Nous avons utilisé ImageJ (version : 2.1.0, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) pour compter le nombre de cellules positives TRAP dans le ROI et Fiji2 (version : 1.0, US National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) pour compter le nombre de cellules positives à coloration multiplex TUNEL et immunofluorescence dans le ROI. Nous avons testé quatre échantillons provenant de quatre rats (n = 4). Chaque rat a été soumis à une expérience indépendante.

La solution de PEG-200 a été préparée en dissolvant du polyéthylène glycol 200 (PEG-200, n° de catalogue : ESL3444, FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Osaka, Japon) dans MillQ. Le dasatinib (n° de catalogue : 11498, Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA) et la quercétine (n° de catalogue : sc-206089A, SCB Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas, TX, USA) ont été dissous dans la solution de PEG-200 préparée ci-dessus et mélangés soigneusement pour faire des sénolytiques. Chaque rat du groupe post-stress a reçu par voie orale des sénolytiques à 6,67 mg·kg-1 (D) et 66,7 mg·kg-1 (Q) les jours 1 et 7 après l'installation de la boucle en L, respectivement.

Toutes les données ont été analysées statistiquement à l'aide de Prism 8 (GraphPad Software Co., San Diego, CA, USA). Tous les résultats ont été présentés sous forme de moyennes ± écarts-types. Le test t de Student a été utilisé pour les comparaisons entre deux groupes. Une analyse de variance unidirectionnelle suivie du post-test de comparaison multiple de Tukey a été effectuée pour les comparaisons entre cinq groupes. Une valeur P <0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Toutes les données associées à cette étude sont présentées dans le document.

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Nous remercions Ye Zhang, Yuzhu Sun (Département des biomatériaux, Université dentaire d'Osaka), Jianxin Zhao, Yoshitsugu Nakamoto, Yosuke Miyaji, Hiroshi Matoba (Département d'orthodontie, Université dentaire d'Osaka) pour avoir conseillé les expérimentations animales, et Keita Yoshida (Département d'anesthésiologie, Université dentaire d'Osaka) et Yuya Hirai (Département de biologie, Université dentaire d'Osaka) pour leur soutien dans l'Immunoflu coloration orescente. Ce travail a été soutenu par JST, CREST Grant Number JPMJCR22L5, Japon.

Département d'orthodontie, Université dentaire d'Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japon

Yue Zhou, Aki Nishiura, Hidetoshi Morikuni, Wenqi Deng et Naoyuki Matsumoto

Département de physique, Université dentaire d'Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japon

Toru Tsujibayashi

Département d'anesthésiologie, Université dentaire d'Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japon

Yoshihiro Momota

Département de pharmacologie, Showa University School of Dentistry, 1-5-8 Hatanodai, Shinagawaku, Tokyo, Japon

Yuki Azetsu et Masamichi Takami

Département d'anatomie buccale, Université dentaire d'Osaka, 8-1 Kuzuhahanazonocho, Hirakata, Osaka, Japon

Yoshitomo Honda

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AN, YH et YZ ont conçu et conçu la recherche. YZ, WD et AN ont réalisé une expérience. YZ, AN, YA, MT et YH ont analysé les données. YH, YZ et AN ont rédigé le brouillon et le manuscrit. Article révisé HM, TT, YM, YA, MT et NM. AN et YH ont supervisé la recherche. Tous les auteurs ont approuvé la version finale de l'article.

Correspondance à Aki Nishiura ou Yoshitomo Honda.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Zhou, Y., Nishiura, A., Morikuni, H. et al. Cellules sénescentes RANKL+ sous stress mécanique : une cible thérapeutique pour la résorption radiculaire orthodontique par sénolytique. Int J Oral Sci 15, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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Reçu : 15 octobre 2022

Révisé : 29 avril 2023

Accepté : 04 mai 2023

Publié: 30 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41368-023-00228-1

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